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PCR反應(yīng)沒有目的片段考慮方面
日期：2025-02-05 20:04
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摘要：PCR反應(yīng)沒有目的片段考慮方面:
1. 含有PCR反應(yīng)抑制物
對樣本稀釋(l: 100 和1:1000) 后再擴(kuò)增，并通過在已知陽性模板中加入原始PCR 混合物進(jìn)行擴(kuò)增，驗證抑制物的存在；
2. 模板濃度太低，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不夠
盡可能降低退火溫度，在降落PCR 的低溫度增加10個擴(kuò)增循環(huán)；
3. 非特異擴(kuò)增
增加起始模板的變性溫度(通常為95℃ 5min)，采用降落PCR和熱啟動PCR
4. 擴(kuò)增反應(yīng)混合液中各成分濃度不對
改變TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的濃度及緩沖液的pH
5. 原始模板濃度太低
使用巢式引物...
PCR反應(yīng)沒有目的片段考慮方面:
1. 含有PCR反應(yīng)抑制物
對樣本稀釋(l: 100 和1:1000) 后再擴(kuò)增，并通過在已知陽性模板中加入原始PCR 混合物進(jìn)行擴(kuò)增，驗證抑制物的存在；
2. 模板濃度太低，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不夠
盡可能降低退火溫度，在降落PCR 的低溫度增加10個擴(kuò)增循環(huán)；
3. 非特異擴(kuò)增
增加起始模板的變性溫度(通常為95℃ 5min)，采用降落PCR和熱啟動PCR
4. 擴(kuò)增反應(yīng)混合液中各成分濃度不對
改變TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的濃度及緩沖液的pH
5. 原始模板濃度太低
使用巢式引物對第1次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行稀釋（l :100 和1:1000)后擴(kuò)增；
6. 擴(kuò)增需要增強(qiáng)劑
加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亞楓CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增強(qiáng)劑
7. 引物設(shè)計存在問題
重新設(shè)計引物
1. 含有PCR反應(yīng)抑制物
對樣本稀釋(l: 100 和1:1000) 后再擴(kuò)增，并通過在已知陽性模板中加入原始PCR 混合物進(jìn)行擴(kuò)增，驗證抑制物的存在；
2. 模板濃度太低，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不夠
盡可能降低退火溫度，在降落PCR 的低溫度增加10個擴(kuò)增循環(huán)；
3. 非特異擴(kuò)增
增加起始模板的變性溫度(通常為95℃ 5min)，采用降落PCR和熱啟動PCR
4. 擴(kuò)增反應(yīng)混合液中各成分濃度不對
改變TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的濃度及緩沖液的pH
5. 原始模板濃度太低
使用巢式引物對第1次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行稀釋（l :100 和1:1000)后擴(kuò)增；
6. 擴(kuò)增需要增強(qiáng)劑
加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亞楓CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增強(qiáng)劑
7. 引物設(shè)計存在問題
重新設(shè)計引物